产品使用说明书(Version 3.0)

产品名称:4×预混型快速逆转录试剂盒

英文名称:4×Reverse Transcription Master Mix

货号规格:UR32051(100 Rxns×20μL)

运输存储:冰袋运输,-20℃存储。

产品描述:

 本试剂盒为包含去除基因组DNA的高效DNase的快速逆转录试剂盒,主要包括两种试剂:1) gDNA Remover试剂中包含浓缩的DNase及buffer;2) 4× RT Master Mix试剂中包含逆转录所需的所有成分(逆转录酶、buffer、RNase Inhibitor、dNTPs、Oligo dT18、Random Hexamer等)。

本试剂盒采用的DNase及buffer反应系统经过特殊的优化,仅需室温(19 ~ 27℃)反应5分钟,就能降解95%以上的基因组DNA,极大地降低了残留基因组对结果的干扰。

本试剂盒采用的新型M-MLV突变体逆转录酶具有很强的抗干扰能力及扩增能力,15分钟得到的扩增产物量可以达到AMV逆转录酶大约1小时的产物量(Ct值相同)。后续逆转录产物建议用于PCR、qPCR,不建议用于基因克隆。

产品组分:

产品使用:

 使用前将gDNA Remover、4× RT Master Mix从冰箱中取出,上下颠倒5 ~ 10次使之充分混匀,然后使用离心机短暂离心将管壁上附着的液体甩下来,置于冰上待用。

去除基因组DNA反应

1、 用gDNA Remover处理RNA:取100 ng ~ 2 μg的总RNA(一般建议使用1 μg的总RNA),加入2 μL gDNA Remover,用移液器轻柔吹打10次左右使之充分混匀,使用离心机短暂离心至管底,然后室温(19 ~ 27℃)反应5分钟,反应结束后置于冰上(如需使RNA二级结构变性,可将RNA在65℃下孵育5 min,然后迅速冰上冷却)。

逆转录反应

2、 上述步骤反应结束后,按照如下体系配制逆转录反应体系,即向上述gDNA Remover处理过的总RNA中,加入5 μL的4× RT Master Mix,然后加入ddH2O补足至20 μL:

3、按照上表加好试剂后,必须用移液器轻柔吹打10次左右使之充分混匀(注:混匀时建议将移液器刻度调到18 μL左右),然后使用离心机短暂离心至管底。

3、 逆转录反应条件:42℃反应15分钟,95℃反应30秒;逆转录反应结束后得到的产物即为cDNA。

4、 逆转录反应得到的cDNA可直接作为模板进行qPCR反应,或者稀释5 ~ 10倍后再使用(具体的稀释倍数根据基因表达丰度来确定)。在20 μL 的qPCR反应体系中:如果模板cDNA不稀释,建议使用0.4 μL的cDNA(0.2 ~ 0.8 μL);如果模板cDNA稀释5倍,建议使用2 μL的cDNA(1 ~ 4 μL);如果模板cDNA稀释10倍,建议使用4 μL的cDNA(2 ~ 8 μL)。如不立即进行qPCR实验,建议将cDNA冻存于-80℃冰箱中。

常见的注意事项、操作要点及优化方法:

1、 实验开始前首先验证qPCR引物是否适用,标准与上述标准类似,主要观察扩增曲线与熔解曲线;

2、 引物验证后应该分装为几份,防止污染或降解;

3、 RNA的质量及cDNA的质量对qPCR的结果具有很大的影响,应尽量保证RNA不降解。RNA提取后应尽快进行逆转录反应,避免反复冻融,或者多次逆转录反应。如果预计使用量较大,则可以一次多逆转录几管cDNA。如果条件允许,cDNA建议保存在-80℃冰箱。

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